高致病禽流感病毒H7亞型HP-H7熒光PCR試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：高致病性禽流感病毒 H7 亞型（HP-H7）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR 法）

Name ：Highly Pathogenic Avian Influenza Virus subtype H7 Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

禽流感是由正粘病毒科流感病毒屬的 A 型流感病毒引起的一種禽類或人類感染的傳染病，分為非致病性、低致病性和高致病性三類[1]。高致病性禽流感是家禽的重要烈性 傳染病，發(fā)病率和病死率可高達 100％，對養(yǎng)禽業(yè)危害極大。H7 亞型禽流感因 HA 基因裂解位點的差異表現(xiàn)為高低致病性，及時檢測 H7 亞型流感致病性具有重要意義。

本試劑盒利用實時熒光 PCR 原理，檢測高致病 H7 亞型禽流感病毒，對高致病H7 亞型禽流感引起的流感的診斷有重要指導意義。

【檢驗原理】

本試劑盒根據(jù)高致病性H7 亞型禽流感HA 基因裂解位點設計特異性引物和探針， 在反應體系中含高致病H7 亞型禽流感病毒基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對 PCR 過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出， 實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性、定量分析。

【試劑組成】

注：

1） 不同批號試劑不能混用。

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；棉拭子直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2 RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0和明顯擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴增曲線。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結(jié)果不樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

Ø 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

【注意事項】

Ø 所有操作嚴格按照說明書進行；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø 反應液應避光保存；

Ø 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

• Chaharaein B, Omar A R, Aini I, Yusoff K, Hassan S S. Detection of H5, H7 and H9 subtypes of avian influenza viruses by multiplex reverse transcription polymerase chain reaction. Microbiological Research, 2009, 164(2): 174-179.
• Chmielewski R, Swayne D E. Avian influenza: public health and food safety concerns. Annual Review of Food Science and Technology, 2011, 2:37-57.

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：上海烜雅生物科技有限公司

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