熒光定量PCR是一種在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的核酸定量技術(shù)，通過引入熒光信號實時監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，實現(xiàn)了從定性到定量的跨越式發(fā)展。作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)之一，qPCR在疾病診斷、基因表達(dá)分析、病原體檢測和轉(zhuǎn)基因檢測等方面具有不可替代的優(yōu)勢。
一、高靈敏度和特異性：精準(zhǔn)檢測的基石
熒光定量PCR的靈敏度可達(dá)單個拷貝的核酸分子水平，能夠檢測低至1-10拷貝的靶序列。其高靈敏度的實現(xiàn)依賴于以下機(jī)制：
?熒光探針/染料的信號放大：通過SYBRGreen染料或TaqMan探針等熒光標(biāo)記物，qPCR可將核酸擴(kuò)增過程轉(zhuǎn)化為可實時監(jiān)測的熒光信號，避免傳統(tǒng)PCR電泳檢測的靈敏度限制。
?閉管操作減少污染：整個反應(yīng)在密閉管中進(jìn)行，無需開蓋處理，降低了氣溶膠污染風(fēng)險，尤其適用于痕量樣本(如循環(huán)腫瘤DNA、病毒早期感染樣本)的檢測。
特異性方面，qPCR通過兩種策略顯著提升：
?探針特異性：如TaqMan探針通過設(shè)計特異性熒光標(biāo)記探針，僅在靶序列存在時釋放熒光信號，有效排除非特異擴(kuò)增。
?熔解曲線分析：結(jié)合擴(kuò)增后的熔解曲線分析，可驗證產(chǎn)物是否為單一目標(biāo)片段，進(jìn)一步確保結(jié)果準(zhǔn)確性。
二、實時定量能力：從終點(diǎn)到過程的跨越
傳統(tǒng)PCR僅能通過終點(diǎn)法半定量分析產(chǎn)物，而熒光定量PCR通過動態(tài)監(jiān)測熒光信號，可精確計算初始模板量，其核心優(yōu)勢體現(xiàn)在：
?Ct值的定量標(biāo)準(zhǔn)：通過閾值循環(huán)數(shù)(Cyclethreshold,Ct值)與起始模板濃度的對數(shù)線性關(guān)系，實現(xiàn)絕對或相對定量。例如，在新冠病毒檢測中，Ct值<40可判定為陽性，且Ct值越低代表病毒載量越高。
?寬動態(tài)范圍：qPCR可檢測跨越6-8個數(shù)量級的濃度差異，適用于基因表達(dá)水平的跨度分析。
三、高通量與自動化：效率提升的關(guān)鍵
現(xiàn)代熒光定量PCR儀通常支持96孔或384孔板同時運(yùn)行，可在2小時內(nèi)完成數(shù)百個樣本的檢測，顯著提升檢測效率。例如，在流行病學(xué)篩查中，一臺儀器單日可處理上千份樣本。此外，自動化分析軟件可自動計算Ct值并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少人為誤差，特別適合大規(guī)模臨床或科研項目。
四、多色熒光檢測：多重分析的突破
通過使用不同熒光標(biāo)記的探針，qPCR可在一個反應(yīng)體系中同時檢測多個靶標(biāo)。例如：
?病原體分型檢測：同時檢測流感病毒A/B型及亞型。
?內(nèi)參基因校正：在基因表達(dá)分析中，利用內(nèi)參基因(如GAPDH)校正樣本間差異，提高數(shù)據(jù)可靠性。
